人端粒酶逆转录酶抗原HLA-A0201限制性CTL表位预测及鉴定

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.003

中华肺部疾病杂志(电子版) ›› 2017, Vol. 10 ›› Issue (03) : 257 -262. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.003

所属专题：文献；

论著

人端粒酶逆转录酶抗原HLA-A0201限制性CTL表位预测及鉴定

袁竞妍¹, 王宇², 刘博轩¹, 孟夏¹, 孙瑞瑛¹, 吕欣¹, 李维¹, 石婕¹, 明宗娟¹, 史红阳¹, 杨拴盈¹^,^†(

)

^1. 710004，西安，西安交通大学第二附属医院呼吸内科
^2. 710004，西安，西安交通大学第二附属医院心脏外科

收稿日期:2017-05-08 出版日期:2017-06-20
通信作者: 杨拴盈
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81172234); 陕西省科技统筹创新工程计划项目(2014KTCL03-02); 中央高校基本科研业务费交叉重点项目(XKJC2015001)

Prediction and identification of HLA-A0201 restricted CTL epitopes derived from human telomerase reverse transcriptase antigen

Jingyan Yuan¹, Yu Wang², Boxuan Liu¹, Xia Meng¹, Ruiying Sun¹, Xin Lyu¹, Wei Li¹, Jie Shi¹, Zongjuan Ming¹, Hongyang Shi¹, Shuanying Yang¹^,^†()

^1. Department of Respiratory Medicine, the second affiliated hospital, Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710004, China
^2. Department of cardiac surgical, the second affiliated hospital, Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710004, China

Received:2017-05-08 Published:2017-06-20
Corresponding author: Shuanying Yang
About author:
Corresponding author: Yang Shuanying, Email: Yangshuanying66@163.com

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引用本文：

袁竞妍, 王宇, 刘博轩, 孟夏, 孙瑞瑛, 吕欣, 李维, 石婕, 明宗娟, 史红阳, 杨拴盈. 人端粒酶逆转录酶抗原HLA-A0201限制性CTL表位预测及鉴定[J/OL]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2017, 10(03): 257-262.

Jingyan Yuan, Yu Wang, Boxuan Liu, Xia Meng, Ruiying Sun, Xin Lyu, Wei Li, Jie Shi, Zongjuan Ming, Hongyang Shi, Shuanying Yang. Prediction and identification of HLA-A0201 restricted CTL epitopes derived from human telomerase reverse transcriptase antigen[J/OL]. Chinese Journal of Lung Diseases(Electronic Edition), 2017, 10(03): 257-262.

目的

应用生物信息学方法对人端粒酶逆转录酶(hTERT)HLA-A2^＋限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位进行预测和鉴定，寻找诱导机体特异性杀伤肺癌肿瘤细胞的抗原表位。

方法

应用生物信息学软件BIMAS、SYFPEITHI对hTERT蛋白进行HLA-A0201限制性CTL抗原表位预测，筛选优势表位；应用肽亲和力实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验及人干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT实验验证表位，筛选出激发机体产生特异性免疫反应的表位。

结果

生物信息学软件筛选出优势表位为：ILAKFLHWL、ELLRSFFYV及ILSTLLCSL；肽亲和力实验得到优势表位荧光系数(FI)为：ILAKFLHWL0.67、ELLRSFFYV0.66及ILSTLLCSL0.90；LDH释放实验显示ILAKFLHWL所诱导CTLs的杀伤率明显高于其它各表位，也明显高于阴性表位，差异均具有统计学意义(P<0.05)；人IFN-γ ELISPOT实验证明ILAKFLHWL所诱导的CTLs产生的IFN-γ斑点数多于其他表位，差异具有统计学意义(P<0.05)。

结论

ILAKFLHWL的免疫原性强，可用于后续制备肺癌多肽疫苗。

关键词: 支气管肺癌, hTERT, 表位预测, 表位鉴定, 免疫

Objective

HLA-A0201 restricted epitopes were screened for the hTERT protein, and the dominant epitopes were obtained. Then the immunogenicity of the dominant epitopes were detected, finally 1-2 stronger epitopes were acquired which could induced stronger immune response.

Method

applied bioinformatics software BIMAS and SYFPEITHI to predict hTERT protein HLA-A0201 restricted CTL epitopes. Then screened dominant epitopes according to the score of two kinds of software. Next, applied peptide affinity experiment, lactate dehydrogenase(LDH) release assay as well as human interfron gamma(IFN-γ) ELISPOT epitope screening experiments to veriify dominant epitopes. Finally, acquired the epitopes which had ability to elicit stronger immune respons.

Results

Comprehensive analysis of SYFPEITHI software and BIMAS software for HLA-A0201 restricted CTL antigen epitope prediction of hTERT protein showed that 3 peptides were better than others. They were ILAKFLHWL, ELLRSFFYV and ILSTLLCSL. The result of peptide affinty experiment showed that the fluorescence index(FI) of each peptide was ILAKFLHWL 0.67, ELLRSFFYV 0.66 and ILSTLLCSL 0.90; The result of LDH releasing assay showed that the killing rate of ILAKFLHWL was significantly higher than other peptides and negative peptide(P<0.05); The result of human IFN-γ ELISPOT test showed that the number of spots elicited by ILAKFLHWL epitope was significantly higher than other epitopes(P<0.05).

Conclusions

The PBMCs cells induced by epitope ILAKFLHWL had a most significant killing effect. The epitope ILAKFLHWL could be used to make lung cancer poly-peptide vaccine.

Key words: Bronchogenic lung carcinoma, hTERT, Epitope prediction, Immune

表1 BIMAS软件预测hTERT CTL天然表位得分表

序号	起始位点	氨基酸序列	得分
1	540	ILAKFLHWL	1 745.714
2	555	ELLRSFFYV	1 169.814
3	152	LLARCALFV	650.311
4	1 072	VLCHQAFLL	569.949
5	865	RLVDDFLLV	541.810
6	572	RLFFYRKSV	257.342
7	1 017	LQLPFHQQV	168.552
8	30	RLGPQGWRL	160.218
9	504	SLQELTWKM	152.766
10	95	NVLAFGFAL	152.430

表1 BIMAS软件预测hTERT CTL天然表位得分表

序号	起始位点	氨基酸序列	得分
1	540	ILAKFLHWL	1 745.714
2	555	ELLRSFFYV	1 169.814
3	152	LLARCALFV	650.311
4	1 072	VLCHQAFLL	569.949
5	865	RLVDDFLLV	541.810
6	572	RLFFYRKSV	257.342
7	1 017	LQLPFHQQV	168.552
8	30	RLGPQGWRL	160.218
9	504	SLQELTWKM	152.766
10	95	NVLAFGFAL	152.430

表2 SYFPEITHI软件预测hTERT CTL天然表位得分表

序号	起始位点	氨基酸序列	得分
1	540	ILAKFLHWL	30
2	548	LMSVYVVEL	29
3	836	ILSTLLCSL	29
4	76	CLKELVARV	28
5	675	LLGASVLGL	28
6	986	FLDLQVNSL	28
7	724	RLTEVIASI	27
8	772	YMRQFVAHL	27
9	883	FLRTLVRGV	27
10	932	GLLLDTRTL	27
1	540	ILAKFLHWL	30

表2 SYFPEITHI软件预测hTERT CTL天然表位得分表

序号	起始位点	氨基酸序列	得分
1	540	ILAKFLHWL	30
2	548	LMSVYVVEL	29
3	836	ILSTLLCSL	29
4	76	CLKELVARV	28
5	675	LLGASVLGL	28
6	986	FLDLQVNSL	28
7	724	RLTEVIASI	27
8	772	YMRQFVAHL	27
9	883	FLRTLVRGV	27
10	932	GLLLDTRTL	27
1	540	ILAKFLHWL	30

表3 各实验肽荧光系数

氨基酸序列	位点	荧光系数(FI)	编号
ELLRSFFYV	555-563	0.66	P1
ILAKFLHWL	540-548	0.67	P2
ILSTLLCSL	836-844	0.90	P3
AHTKDGFNF	阴性表位	0.25	阴性表位

表3 各实验肽荧光系数

氨基酸序列	位点	荧光系数(FI)	编号
ELLRSFFYV	555-563	0.66	P1
ILAKFLHWL	540-548	0.67	P2
ILSTLLCSL	836-844	0.90	P3
AHTKDGFNF	阴性表位	0.25	阴性表位

图1 LDH释放实验结果

图2 CTL分泌的IFN-γ斑点数；注：*实验组和抗体封闭组比较，P<0.05；#肽P1及肽P2的实验组和肽P3组、阴性组比较，P<0.05；

表4 CTL分泌的IFN-γ斑点数(单位：个)

编号	P1组	P2组	P3组	阴性组	无肽组
PHA组	459.00±14.80	451.67±8.02	442.50±109.60	364.67±18.72	388.33±34.02
实验组	14.67±0.58^ab	28.00±5.00^ab	6.33±3.06	8.67±3.06	6.33±2.08
抗体封闭组	8.00±1.00	9.00±2.65	5.33±1.15	5.67±3.06	10.67±4.62

表4 CTL分泌的IFN-γ斑点数(单位：个)

编号	P1组	P2组	P3组	阴性组	无肽组
PHA组	459.00±14.80	451.67±8.02	442.50±109.60	364.67±18.72	388.33±34.02
实验组	14.67±0.58^ab	28.00±5.00^ab	6.33±3.06	8.67±3.06	6.33±2.08
抗体封闭组	8.00±1.00	9.00±2.65	5.33±1.15	5.67±3.06	10.67±4.62

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