MLVA用于新疆部分地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.013

中华肺部疾病杂志(电子版) ›› 2017, Vol. 10 ›› Issue (03) : 304 -308. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.013

所属专题：文献；

论著

MLVA用于新疆部分地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究

龚新记¹, 李月华², 姚丽丹³, 阿依努尔·莫合买提², 刘年强², 王乐², 王晶⁴^,^†(

)

^1. 830000　新疆医科大学第一附属医院呼吸科
^2. 830001　新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心·结核病预防控制中心
^3. 830000　新疆医科大学第一附属医院重症医学科
^4. 830000　新疆医科大学第一附属医院老年病科

收稿日期:2016-04-30 出版日期:2017-06-20
通信作者: 王晶
基金资助:
新疆重大疾病医学重点实验室开放课题基金资助项目(SKLIB-XJMDR-2012-2，SKLIB-XJMDR-2014-14 SKLIB-XJMDR-2016-4); 2016年新疆医科大学研究生创新创业基金项目(CXCY015)

Preliminary study on genotype of Mycobacterium tuberculosis in some areas of Xinjiang by the multiple locus VNTR analysis

Xinji Gong¹, Yuehua Li², Lidan Yao³, Mokomti Aynur·², Nianqiang Liu², Le Wang², Jing Wang⁴^,^†()

^1. Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumchi 830000 China
^2. Institute for Tuberculosis Control and Prevention, Centre for Disease Control and Prevention of Xinjiang Uygur Autonomously Region, Urumchi 830001 China
^3. Department of Critical Care Medicine, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumchi 830000 China
^4. Department of Geratology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumchi 830000 China

Received:2016-04-30 Published:2017-06-20
Corresponding author: Jing Wang
About author:
Corresponding author: Wang Jing, Email: tlfwj@163.com

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引用本文：

龚新记, 李月华, 姚丽丹, 阿依努尔·莫合买提, 刘年强, 王乐, 王晶. MLVA用于新疆部分地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究[J]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2017, 10(03): 304-308.

Xinji Gong, Yuehua Li, Lidan Yao, Mokomti Aynur·, Nianqiang Liu, Le Wang, Jing Wang. Preliminary study on genotype of Mycobacterium tuberculosis in some areas of Xinjiang by the multiple locus VNTR analysis[J]. Chinese Journal of Lung Diseases(Electronic Edition), 2017, 10(03): 304-308.

目的

探讨结核菌株进行多位点可变数目串联重复序列分析(the multiple locus VNTR analysis, MLVA)。

方法

选择2010年至2011年新疆维吾尔自治区第五次结核病流行病学抽样调查资料，采用经典24位点方法进行基因分型。并采用BioNumerics5.0数据库进行基因聚类分析。将结核分枝杆菌原始株，取一菌环溶于400 μl TE中悬菌，80 ℃ 1 h灭活，12 000 r/min离心10 min，弃上清，600 μl TE重新悬菌，进行多位点串联重复序列分析。

结果

新疆99株结核分枝杆菌分为2个基因群：分别为基因群Ⅰ和基因群Ⅱ，基因群Ⅰ66株(66.7%)，基因株Ⅱ33株(33.3%)；基因群Ⅰ是北京家族，基因群Ⅰ的66株结核分枝杆菌有65种不同的基因型，有2株结核分枝杆菌属于同一簇，成簇率为1.5%，基因群II33株结核分枝杆菌菌株的MLVA图谱不同，成簇率为0。

结论

新疆结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性，以北京基因型菌株为主，同时还存在一定比例的非北京基因型，应加强对主要流行菌株流行的监控及管理。

关键词: 结核病, 结核分枝杆菌, MLVA, 基因多态性, 新疆地区

Objective

To explore the multiple locus VNTR analysis (MLVA) of Mycobacterium tuberculosis.

Methods

It was selected that the data of the fifth TB epidemiological sampling survey in Xinjiang Uygur Autonomously Region from 2010 to 2011, and the genotyping was carried out by the classic 24 site method. The genetic clustering was analyzed by the BioNumerics5.0 database. The original strains of Mycobacterium tuberculosis, the annulus were dissolved and suspended bacterium in 400 μl TE, 80 ℃ 1 h inactivated, 12 000 r/min, the centrifugal 10 min, abandon supernatant, suspended bacterium in 600 μl TE again; multiple site tandem repeat sequence analysis.

Results

There were two genetic groups in Xinjiang: gene group Ⅰ and gene group Ⅱ, 66 strains in genetic group Ⅰ (66.7%), and 33 strains in gene strain Ⅱ (33.3%). gene growp I was Beijing genotype strains 65 different genotype from gene group of 66 strains of Mycobacterium tuberculosis Ⅰ, 2 strains of Mycobacterium tuberculosis belong to the same cluster, clusters rate was 1.5%, It was different that the gene group of Ⅱ 33 of Mycobacterium tuberculosis strain of MLVA pictures, clusters rate was 0.

Conclusion

Mycobacterium tuberculosis strains exist obvious gene polymorphism in Xinjiang, with the majority of Beijing genotype strains, and a certain proportion of strains are not Beijing genotype, we should strengthen the monitoring and management for major epidemic strains.

Key words: Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Multiple locus VNTR analysis, Gene polymorphism, Xinjiang areas

表1 VNTR 24经典位点H37Rv长度与重复次数

位点	H37RV片段长度	H37RV侧翼长度	H37RV重复长度	H37RV重复数	常见重复次数
QUB-11b	412bp	67bp	69bp	5次	3～7
Mtub21	206bp	92bp	57bp	2次	1～6
QUB-26	718bp	163bp	111bp	5次	3～10
QUB-4156	681bp	563bp	59bp	2次	1～5
MIRU26	438bp	285bp	51bp	3次	3～9
Mtub04	639bp	537bp	51bp	2次	2～5
ETRA	420bp	195bp	75bp	3次	2～4
MIRU40	408bp	354bp	54bp	1次	1～4
Mtub39	562bp	272bp	58bp	5次	1～6
MIRU31，ETRE	651bp	492bp	53bp	3次	4～6
MIRU10	643bp	484bp	53bp	3次	1～3
MIRU4，ETRD	353bp	122bp	77bp	3次	0～3
ETRC	382bp	150bp	58bp	4次	2～6
MIRU16	671bp	565bp	53bp	2次	2～4
Mtub30	363bp	247bp	58bp	2次	2～5
Mtub29	563bp	335bp	57bp	4次	2～4
MIRU39	646bp	540bp	53bp	2次	2～4
MIRU27，QUB-5	657bp	498bp	53bp	3次	2～3
ETRB	518bp	347bp	57bp	3次	1～2
Mtub34	488bp	326bp	54bp	3次	3～4
MIRU23	465bp	147bp	53bp	6次	5～6
MIRU20	591bp	437bp	77bp	2次	1～2
MIRU2	508bp	402bp	53bp	2次	2
MIRU24	447bp	339bp	54bp	1次	1

表1 VNTR 24经典位点H37Rv长度与重复次数

位点	H37RV片段长度	H37RV侧翼长度	H37RV重复长度	H37RV重复数	常见重复次数
QUB-11b	412bp	67bp	69bp	5次	3～7
Mtub21	206bp	92bp	57bp	2次	1～6
QUB-26	718bp	163bp	111bp	5次	3～10
QUB-4156	681bp	563bp	59bp	2次	1～5
MIRU26	438bp	285bp	51bp	3次	3～9
Mtub04	639bp	537bp	51bp	2次	2～5
ETRA	420bp	195bp	75bp	3次	2～4
MIRU40	408bp	354bp	54bp	1次	1～4
Mtub39	562bp	272bp	58bp	5次	1～6
MIRU31，ETRE	651bp	492bp	53bp	3次	4～6
MIRU10	643bp	484bp	53bp	3次	1～3
MIRU4，ETRD	353bp	122bp	77bp	3次	0～3
ETRC	382bp	150bp	58bp	4次	2～6
MIRU16	671bp	565bp	53bp	2次	2～4
Mtub30	363bp	247bp	58bp	2次	2～5
Mtub29	563bp	335bp	57bp	4次	2～4
MIRU39	646bp	540bp	53bp	2次	2～4
MIRU27，QUB-5	657bp	498bp	53bp	3次	2～3
ETRB	518bp	347bp	57bp	3次	1～2
Mtub34	488bp	326bp	54bp	3次	3～4
MIRU23	465bp	147bp	53bp	6次	5～6
MIRU20	591bp	437bp	77bp	2次	1～2
MIRU2	508bp	402bp	53bp	2次	2
MIRU24	447bp	339bp	54bp	1次	1

表2 24经典位点引物序列

位点名称	引物序列	碱基	位点名称	引物序列	碱基
MIRU4-a(上游)	5′-gCgCgAgAgCCCgAACTgC-3′	19	Mtub21-a	5′-AgATCCCAgTTgTCgTCgTC-3′	20
MIRU4-b(下游)	5′-gCgCAgCAgAAACgCCAgC-3′	19	Mtub21-b	5′-CAACATCgCCTggTTCTgTA-3′	20
MIRU26-a	5′-TAggTCTACCgTCgAAATCTgTgAC-3′	25	QUB-26-a	5′-AACgCTCAgCTgTCggAT-3′	18
MIRU26-b	5′-CATAggCgACCAggCgAATAg-3′	21	QUB-26-b	5′-CggCCgTgCCggCCAggTCCTTCCCgAT-3′	28
MIRU40-a	5′-gggTTgCTggATgACAACgTgT-3′	22	MIRU2-a	5′-TggACTTgCAgCAATggACCAACT-3′	24
MIRU40-b	5′-gggTgATCTCggCgAAATCAgATA-3′	24	MIRU2-b	5′-TACTCggACgCCggCTCAAAAT-3′	22
MIRU10-a	5′-gTTCTTgACCAACTgCAgTCgTCC-3′	24	MIRU23-a	5′-CTgTCgATggCCgCAACAAAACg-3′	23
MIRU10-b	5′-gCCACCTTggTgATCAgCTACCT-3′	23	MIRU23-b	5′-AgCTCAACgggTTCgCCCTTTTgTC-3′	25
MIRU16-a	5′-TCggTgATCgggTCCAgTCCAAgTA-3′	25	MIRU39-a	5′-CgCATCgACAAACTggAgCCAAAC-3′	24
MIRU16-b	5′-CCCgTCgTgCAgCCCTggTAC-3′	21	MIRU39-b	5′-CggAAACgTCTACgCCCCACACAT-3′	24
MIRU31-a	5′-ACTgATTggCTTCATACggCTTTA-3′	24	MIRU20-a	5′-TCggAgAgATgCCCTTCgAgTTAg-3′	24
MIRU31-b	5′-gTgCCgACgTggTCTTgAT-3′	19	MIRU20-b	5′-ggAgACCgCgACCAggTACTTgTA-3′	24
Mtub04-a	5′-CTTggCCggCATCAAgCgCATTATT-3′	25	MIRU24-a	5′-CgACCAAgATgTgCAggAATACAT-3′	24
Mtub04-b	5′-ggCAgCAgAgCCCgggATTCTTC-3′	23	MIRU24-b	5′-gggCgAgTTgAgCTCACAgAA-3′	21
ETRC-a	5′-CgAgAgTggCAgTggCggTTATCT-3′	24	MIRU27-a	5′-TCgAAAgCCTCTgCgTgCCAgTAA-3′	24
ETRC-b	5′-AATgACTTgAACgCgCAAATTgTgA-3′	25	MIRU27-b	5′-gCgATgTgAgCgTgCCACTCAA-3′	22
ETRA-a	5′-AAATCggTCCCATCACCTTCTTAT-3′	24	Mtub29-a	5′-gCCAgCCgCCgTgCATAAACCT-3′	22
ETRA-b	5′-CgAAgCCTggggTgCCCgCgATTT-3′	24	Mtub29-b	5′-AgCCACCCggTgTgCCTTgTATgAC-3′	25
Mtub30-a	5′-CTTgAAgCCCCggTCTCATCTgT-3′	23	ETRB-a	5′-ATggCCACCCgATACCgCTTCAgT-3′	24
Mtub30-b	5′-ACTTgAACCCCCACgCCCATTAgTA-3′	25	ETRB-b	5′-CgACgggCCATCTTggATCAgCTAC-3′	25
Mtub39-a	5′-CggTggAggCgATgAACgTCTTC-3′	23	Mtub34-a	5′-ggTgCgCACCTgCTCCAgATAA-3′	22
Mtub39-b	5′-TAgAgCggCACgggggAAAgCTTAg-3′	25	Mtub34-b	5′-ggCTCTCATTgCTggAgggTTgTAC-3′	25
QUB-4156-a	5′-ggATTTAgCAggCTgACCAC-3′	20	QUB-11b-a	5′-CgTAAgggggATgCgggAAATAgg-3′	24
QUB-4156-b	5′-TTACCACCCgggCAgTTTAC-3′	20	QUB-11b-b	5′-CgAAgTgAATggTggCAT-3′	18

表2 24经典位点引物序列

位点名称	引物序列	碱基	位点名称	引物序列	碱基
MIRU4-a(上游)	5′-gCgCgAgAgCCCgAACTgC-3′	19	Mtub21-a	5′-AgATCCCAgTTgTCgTCgTC-3′	20
MIRU4-b(下游)	5′-gCgCAgCAgAAACgCCAgC-3′	19	Mtub21-b	5′-CAACATCgCCTggTTCTgTA-3′	20
MIRU26-a	5′-TAggTCTACCgTCgAAATCTgTgAC-3′	25	QUB-26-a	5′-AACgCTCAgCTgTCggAT-3′	18
MIRU26-b	5′-CATAggCgACCAggCgAATAg-3′	21	QUB-26-b	5′-CggCCgTgCCggCCAggTCCTTCCCgAT-3′	28
MIRU40-a	5′-gggTTgCTggATgACAACgTgT-3′	22	MIRU2-a	5′-TggACTTgCAgCAATggACCAACT-3′	24
MIRU40-b	5′-gggTgATCTCggCgAAATCAgATA-3′	24	MIRU2-b	5′-TACTCggACgCCggCTCAAAAT-3′	22
MIRU10-a	5′-gTTCTTgACCAACTgCAgTCgTCC-3′	24	MIRU23-a	5′-CTgTCgATggCCgCAACAAAACg-3′	23
MIRU10-b	5′-gCCACCTTggTgATCAgCTACCT-3′	23	MIRU23-b	5′-AgCTCAACgggTTCgCCCTTTTgTC-3′	25
MIRU16-a	5′-TCggTgATCgggTCCAgTCCAAgTA-3′	25	MIRU39-a	5′-CgCATCgACAAACTggAgCCAAAC-3′	24
MIRU16-b	5′-CCCgTCgTgCAgCCCTggTAC-3′	21	MIRU39-b	5′-CggAAACgTCTACgCCCCACACAT-3′	24
MIRU31-a	5′-ACTgATTggCTTCATACggCTTTA-3′	24	MIRU20-a	5′-TCggAgAgATgCCCTTCgAgTTAg-3′	24
MIRU31-b	5′-gTgCCgACgTggTCTTgAT-3′	19	MIRU20-b	5′-ggAgACCgCgACCAggTACTTgTA-3′	24
Mtub04-a	5′-CTTggCCggCATCAAgCgCATTATT-3′	25	MIRU24-a	5′-CgACCAAgATgTgCAggAATACAT-3′	24
Mtub04-b	5′-ggCAgCAgAgCCCgggATTCTTC-3′	23	MIRU24-b	5′-gggCgAgTTgAgCTCACAgAA-3′	21
ETRC-a	5′-CgAgAgTggCAgTggCggTTATCT-3′	24	MIRU27-a	5′-TCgAAAgCCTCTgCgTgCCAgTAA-3′	24
ETRC-b	5′-AATgACTTgAACgCgCAAATTgTgA-3′	25	MIRU27-b	5′-gCgATgTgAgCgTgCCACTCAA-3′	22
ETRA-a	5′-AAATCggTCCCATCACCTTCTTAT-3′	24	Mtub29-a	5′-gCCAgCCgCCgTgCATAAACCT-3′	22
ETRA-b	5′-CgAAgCCTggggTgCCCgCgATTT-3′	24	Mtub29-b	5′-AgCCACCCggTgTgCCTTgTATgAC-3′	25
Mtub30-a	5′-CTTgAAgCCCCggTCTCATCTgT-3′	23	ETRB-a	5′-ATggCCACCCgATACCgCTTCAgT-3′	24
Mtub30-b	5′-ACTTgAACCCCCACgCCCATTAgTA-3′	25	ETRB-b	5′-CgACgggCCATCTTggATCAgCTAC-3′	25
Mtub39-a	5′-CggTggAggCgATgAACgTCTTC-3′	23	Mtub34-a	5′-ggTgCgCACCTgCTCCAgATAA-3′	22
Mtub39-b	5′-TAgAgCggCACgggggAAAgCTTAg-3′	25	Mtub34-b	5′-ggCTCTCATTgCTggAgggTTgTAC-3′	25
QUB-4156-a	5′-ggATTTAgCAggCTgACCAC-3′	20	QUB-11b-a	5′-CgTAAgggggATgCgggAAATAgg-3′	24
QUB-4156-b	5′-TTACCACCCgggCAgTTTAC-3′	20	QUB-11b-b	5′-CgAAgTgAATggTggCAT-3′	18

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Preliminary study on genotype of Mycobacterium tuberculosis in some areas of Xinjiang by the multiple locus VNTR analysis

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